|
|
Redox signaling to chromatin
Plšková, Zuzana
Chromatin je velmi dynamická struktura, která podléhá neustálé regulaci v odpovědi na měnící se podmínky prostředí. Tato odpověď je zprostředkovaná enzymy modifikujícími chromatin, jako jsou histonové acetyltransferázy, které přenáší histonové posttranslační modifikace, což vede ke změnám genové exprese. Jedním z těchto enzymů v rostlinách je GENERAL CONTROL NON-REPRESSIBLE 5 (GCN5). Navzdory jeho důležitosti pro růst a vývoji rostlin stále není dostatečně popsáno, jak probíhá jeho regulace. Nové důkazy poukazují na možnou regulaci remodelace chromatinu prostřednictvím redoxně regulovaných enzymů modifikujících chromatin. Abychom prozkoumali možnou redoxní regulaci GCN5, použili jsme redoxně necitlivé linie nesoucí GCN5 s cysteinem zaměněným za serin. Přestože mutantní rostliny gcn5 vykazovaly zvýšenou náchylnost k oxidativnímu stresu vyvolanou paraquatem, linie s mutovaným GCN5 měly fenotyp podobný kontrolním rostlinám. Dále jsme sledovali interaktom GCN5, abychom identifikovali domnělé funkční interaktory, jejichž vazba na GCN5 by mohla být ovlivněna oxidativním stresem či jeho redoxním stavem. Mutace jediného cysteinu ve struktuře GCN5 nevedla k významným změnám jeho interaktoru, což naznačuje, že je třeba prozkoumat vícenásobné mutanty či mutace jiných cysteinů.
|
|
|
Role AGO-hook domény histonového chaperonu SPT6L v regulaci genové exprese
Kašpar, Tomáš ; Čermák, Vojtěch (vedoucí práce) ; Převorovský, Martin (oponent)
AGO-hook domény přítomné u některých eukaryotických proteinů slouží k vazbě proteinů z rodiny ARGONAUTE (AGO). Proteiny AGO fungují v mnoha procesech regulujících expresi genů za pomoci jimi navázané malé RNA (sRNA). sRNA slouží k rozpoznání cílového komplementárního transkriptu. Tato práce si klade za cíl zjistit roli předpokládané AGO-hook domény proteinu SPT6L. SPT6L je transkripční elongační faktor z komplexu RNA polymerázy II (Pol II), kde slouží jako histonový chaperon a účastní se epigenetického značení histonů. SPT6L je u Arabidopsis thaliana jedním ze dvou paralogů proteinu SPT6, který je charakterizován právě přítomností AGO-hook domény, což je ryze rostlinné specifikum. Funkce této domény není u rostliny A. thaliana známá. Přesto by se dalo předpokládat, že tato doména bude zajišťovat navádění proteinů AGO do komplexu Pol II, čímž poté může umožnit regulaci modifikací chromatinu, či kotranskripčně ovlivňovat transkripty Pol II cílené sRNA. Tato práce nastiňuje funkci AGO-hook domény proteinu SPT6L u rostliny A. thaliana. Získané výsledky ukazují interakci AGO-hook domény proteinu SPT6L s AGO a její vliv na expresi a na zpracování transkriptů. Klíčová slova SPT6L, AGO-hook, transkripce, chromatin, Arabidopsis thaliana
|
|
|
Role proteinu Smarca5 (Snf2h) v regulaci transkripce vneseného DNA templátu.
Zikmund, Tomáš ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Smetana, Karel (oponent)
Vlastnosti buněk a tkání jsou výsledkem dynamické regulace genové exprese. DNA zabalená do proteinových struktur, souhrně označovaných jako chromatin, vyžaduje zapojení mechanizmů regulujících přístupnost specifických sekvencí. U eukaryot hrají klíčovou roli při regulaci struktury chromatinu tzv. chromatin-remodelační enzymy, mezi které patří ISWI ATPáza SMARCA5. SMARCA5 se účastní řady biologických procesů na DNA včetně transkripce, přesto význam proteinu SMARCA5 v transkripci především ve vztahu ke změnám chromatinové struktury in vivo není zcela objasněn. Pro tento účel jsme vytvořili a optimalizovali systém, který nám umožnil sledovat vliv intracelulární hladiny proteinu SMARCA5 na genovou expresi a vývoj chromatinové struktury artificiálně vneseného reportérového vektoru. Naše výsledky ukazují, že DNA vneseného reportérového vektoru byla nabohacena specificky tri-methylovanými molekulami histonu H3 na lyzinu 4 (H3K4Me3), které patří mezi známky aktivovaného chromatinu. Po nadprodukci proteinu SMARCA5 došlo v kódující sekvenci reportérového genu k ~2,5-3 násobnému zvýšení relativního nabohacení histonu H3 a jeho methylace (H3K4Me3). Vyšší zapojení molekul reportéru do procesu transkripce vedlo neočekávaně k poklesu reportérové aktivity oproti kontrole. Tyto výsledky podporují přítomnost...
|
|
|
Vývoj a testování buněčných modelů kondiciální inaktivace ISWI ATPázy Smarca5
Tauchmanová, Petra ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Burda, Pavel (oponent)
Jaderné procesy eukaryotických buněk (replikace, transkripce, opravy poškozené DNA a další) jsou z velké části závislé na regulaci chromatinové struktury. Dynamické regulace změn na úrovni chromatinové struktury se účastní i chromatin-remodelační faktory, využívající energii z hydrolýzy ATP. Jedním z těchto faktorů je protein Smarca5 (Snf2h), který je schopen samostatně, nebo s pomocí vazebných partnerů, lokálně měnit strukturu chromatinu. Cílem této práce bylo vytvořit a následně otestovat in vitro model myších embryonálních fibroblastů (MEF) s podmíněnou (kondiciální) delecí genu Smarca5 a testovat vliv této delece na obecné buněčné procesy, jimiž jsou například regulace buněčného cyklu, schopnost proliferace či proces opravy poškozené DNA. Výsledky naznačují, že u linií s deplecí proteinu Smarca5 dochází k výraznému narušení rychlosti proliferace již několik dní po indukci delece. Toto narušení proliferace je doprovázeno zvyšující se ploiditou a snížením množstvím buněk v S fázi a v mitóze. Po depleci proteinu Smarca5 bylo v liniích pozorováno také zvýšené zastoupení buněk v senescenci. Imunoblotová analýza ukázala, že u buněk po depleci Smarca5 dochází k nárůstu markerů indukujících poškození DNA. Získaná data naznačují, že protein Smarca5 hraje roli převážně v replikaci a pravděpodobně v...
|
|
|
Determinants of the splice site selection in protein-coding and long non-coding RNAs
Krchňáková, Zuzana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Svoboda, Petr (oponent) ; Blažek, Dalibor (oponent)
Ve své dizertační práci jsem se zaměřila na několik málo proskoumaných oblastí regulace sestřihu RNA. V první části jsem analyzovala, jak chromatinové a transkripční regulační elementy mění sestřih pre-mRNA. Ve druhé části jsem studovala, proč jsou dlouhé nekódující RNA méně efektivně stříhané než mRNA kódující proteiny. Nakonec jsem zkoumala důležitost intronu pro aktivační funkci dlouhých nekódujících RNA. Bylo ukázáno, že chromatin a promotor mění alternativní sestřih. Zde jsem testovala, zda lokální chromatinové a vzdálené genomové prvky, které ovlivňují transkripci, mohou také modulovat sestřih. Použila jsem enzymy modifikující histony a pomocí TALE technologie je navedla na specifické oblasti ve FOSL1 genu. Pomocí tohoto přístupu jsem ukázala, že změny metylace v lyzínu 9 histónu H3 ovlivňují konstitutivní sestřih. Navíc podávám důkaz, že odstranení transkripčního zesilovače vzdáleného několik kilobází od alternativního exonu mění sestřih alternativního exonu. Mnohé dlouhé nekódujíci RNA podléhají stejnému mechanizmu zpracování jako pre- mRNA genů kódujících proteiny, ale často jsou neefektivně sestřiženy. Abychom identifikovali základní mechanismy tohoto jevu, hledali jsme možné inhibiční sekvence sestřihu u těchto dlouhých nekódujících RNA. Celogenomová analýza ukázala, že obecně dlouhé...
|
|
|
The role of transcription factors PU.1 a GATA-1 during leukemia differentiation.
Burda, Pavel ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Kořínek, Vladimír (oponent) ; Machová Poláková, Kateřina (oponent)
Hematopoéza neboli krvetvorba je proces regulovaný transkripčními faktory, mezi nimiž hrají klíčovou roli molekuly PU.1 (Spi1, Sfpi1) a GATA-1. GATA-1 a PU.1 se mohou na DNA vzájemně vázat a blokovat tím své transkripční programy. Myší erytroleukemické buňky (MEL) jsou transformované erythroidní prekurzory zablokované v pokročilejším stádiu erythroidní diferenciace, současně exprimují PU.1 i GATA-1 a lze u nich navodit erytroidní diferenciaci snížením hladiny PU.1 či zvýšení hladiny GATA-1 v jádře. Ve své práci ukazuji, že v MEL buňkách je PU.1 dependentní transkriptom negativně regulovaný pomocí GATA-1. Tuto represi a následně možnou derepresi podrobněji popisuji na genech Cebpa a Cbfb, které kódují další důležité hematopoetické transkripční faktory. Pomocí chromatinové imunoprecipitace a reportérových esejí jsme identifikovali vazebné sekvence DNA pro vazbu PU.1 na genech Cebpa a Cbfb, na nichž jsme v leukemických blastech detekovali současně faktory PU.1 i GATA-1. Regulace transkripce těchto genů manipulací hladiny PU.1 a GATA-1 zahrnuje kvantitativní změny úrovně acetylace H3K9, známky transkripčně aktivního chromatinu. Data jsou podpořena experimenty ukazujícími, že signifikantní derepresi genů Cebpa a Cbfb lze v MEL buňkách dosáhnout jak aktivací PU.1, tak i inaktivací GATA-1. Má disertační práci...
|
|
|
Aktin a komplex Arp2/3 v jádře
Němcová, Barbora ; Bellinvia, Erica (vedoucí práce) ; Hála, Michal (oponent)
Aktinový cytoskelet je nezbytný pro řadu buněčných procesů, včetně determinace tvaru, vývoje a pohybu buněk, vnitrobuněčný pohyb, regulace genové exprese a reakce na biotický a abiotický stres. Jeho hlavními složkami je aktin a jemu příbuzné proteiny, které vytvářejí obsáhlou rodinu proteinů. Jsou to nejrozšířenější proteiny v živých organismech. Kromě základních funkcí v cytoplazmě má aktin roli také v jádře. Nedávné studie ukázaly, že je aktin aktivně přemisťován z cytoplazmy do jádra, kde reguluje transkripční aktivitu buňky, reguluje RNA polymerázy, podílí se na remodelaci chromatinu a na opravě poškozené DNA. Přítomnost typických aktinových filament v jádře nebyla přímo prokázána, jaderný aktin se ale vyskytuje v mnoha formách jako jsou aktinové tyčinky, krátké polymery aktinu, aktinové monomery nebo komplexy s profilinem či kofilinem. Kromě klasického aktinu většina eukaryotických buněk také obsahuje alespoň jedenáct proteinů podobných aktinu, tzv. ARP (actin related proteins). ARP vykazují značnou příbuznost s aktinem. Nedávné biochemické a genetické studie prokázaly, že proteiny z rodiny ARP mají konzervované role v cytoplazmě i v jádře; některé ARP fungují převážně nebo zcela v jádře. Tyto jaderné ARP jsou uznávány jako klíčové regulátory funkce genomu a ovlivňují nejen remodelaci...
|
|
|
Role sekvenčního kontextu v metylaci DNA
Polák, Jan ; Fischer, Lukáš (vedoucí práce) ; Širl, Marek (oponent)
Metylace DNA v cytosinu je důležitá epigenetická značka, která se podílí na regulaci genové exprese, umlčování transponovatelných elementůch a spoluurčuje celkový stavu chromatinu. Cytosin se v DNA může vyskytovat ve třech kontextech: CG, CHG a CHH (kde H zastupuje C, A, nebo T). Arabidopsis thaliana (a rostliny obecně) disponuje molekulárním aparátem, kterým je schopna metylovat DNA v cytosinu ve všech kontextech. Tento aparát má dva úkoly: udržovat již zavedené metylační značky a v případě potřeby vytvářet nové. Udržování metylace se pro jednotlivé kontexty liší svými mechanismy. K metylaci symetrických kontextů CG a CHG se využívá informace z již metylovaného vlákna. Asymetrické kontexty CHH a i CHG k metylaci využívají informaci z další epigenetické značky: modifikace histonů, konkrétně dimetylace histonu H3 na lysinu 9. Takto vzniká zpětnovazebná smyčka mezi metylací histonů a DNA. Metylace CHH pak také může být naváděna pomocí malých RNA komplementárních k danému místu. Mechanismus navádění metylačního enzymu pomocí malých RNA je také využíván při zavádění nových mDNA značek, a to v případě všech kontextů. Nejvíce je metylován kontext CG, který kromě velkého zastoupení v heterochromatinu je přítomný i v konstitutivně přepisovaných oblastech dlouhých středně intezivně přepisovaných genů....
|
|
|
Epigenetické aspekty normální a nádorové krvetvorby: role chromatin remodelační ISWI ATPázy.
Zikmund, Tomáš ; Stopka, Tomáš (vedoucí práce) ; Dráber, Peter (oponent) ; Otáhal, Pavel (oponent)
Chromatin remodelační protein Smarca5 se účastní řady buněčných procesů, které jsou důležité jak z hlediska vývoje tkání, tak i z pohledu nádorové biologie. Mezi procesy, v průběhu kterých Smarca5 remodeluje chromatinovou strukturu, patří například genová transkripce, replikace a opravy poškozené DNA. Předpokládali jsme, že Smarca5 představuje esenciální molekulu pro modulaci chromatinu především ve vývojově časných a rychle se dělících progenitorech tkání, u nichž se často objevuje i zvýšená hladina transkriptu této ATPázy. Jednou z takovýchto tkání je i krvetvorba. Předmětem předkládané disertační práce je analýza vlivu deplece Smarca5 na proliferaci a diferenciaci krvetvorných progenitorů in vivo a zároveň hledání mechanizmů narušení jejich vývoje. Pomocí námi vytvořeného myšího modelu s podmíněně deletovatelnou alelou (angl. "conditional knockout") genu Smarca5 v krvetvorných kmenových buňkách jsme zjistili, že deplece této ISWI ATPázy způsobuje akumulaci časných hematopoetických protenitorů a inhibici jejich maturace směrem do erytroidní a myeloidní řady. Proerytroblasty vykazovaly dysplastické změny a u podstatné frakce bazofilních erytroblastů se objevovala zástava buněčného cyklu na rozhraní fází G2/M. Předpokládaným mechanizmem pozorovaných změn se ukázala být aktivace stresové dráhy...
|
|
|
Determinants of the splice site selection in protein-coding and long non-coding RNAs
Krchňáková, Zuzana ; Staněk, David (vedoucí práce) ; Svoboda, Petr (oponent) ; Blažek, Dalibor (oponent)
Ve své dizertační práci jsem se zaměřila na několik málo proskoumaných oblastí regulace sestřihu RNA. V první části jsem analyzovala, jak chromatinové a transkripční regulační elementy mění sestřih pre-mRNA. Ve druhé části jsem studovala, proč jsou dlouhé nekódující RNA méně efektivně stříhané než mRNA kódující proteiny. Nakonec jsem zkoumala důležitost intronu pro aktivační funkci dlouhých nekódujících RNA. Bylo ukázáno, že chromatin a promotor mění alternativní sestřih. Zde jsem testovala, zda lokální chromatinové a vzdálené genomové prvky, které ovlivňují transkripci, mohou také modulovat sestřih. Použila jsem enzymy modifikující histony a pomocí TALE technologie je navedla na specifické oblasti ve FOSL1 genu. Pomocí tohoto přístupu jsem ukázala, že změny metylace v lyzínu 9 histónu H3 ovlivňují konstitutivní sestřih. Navíc podávám důkaz, že odstranení transkripčního zesilovače vzdáleného několik kilobází od alternativního exonu mění sestřih alternativního exonu. Mnohé dlouhé nekódujíci RNA podléhají stejnému mechanizmu zpracování jako pre- mRNA genů kódujících proteiny, ale často jsou neefektivně sestřiženy. Abychom identifikovali základní mechanismy tohoto jevu, hledali jsme možné inhibiční sekvence sestřihu u těchto dlouhých nekódujících RNA. Celogenomová analýza ukázala, že obecně dlouhé...
|
host ::
RSS.